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更新时间：2021-09-12 11:04:19

《分子生物学实验》课程教学大纲

课程代码：（宋体五号）

课程负责人：蒋达和

课程中文名称:分子生物学实验

课程英文名称：Experiments of molecular biology

课程类别：必修

课程学分数：1.5

课程学时数：54学时

授课对象：生科院,药学院二年级本科生

本课程的前导课程：分子生物学

一、 教学目的

《分子生物学实验》课程主要从提取和分析遗传物质和基因为基础，从DNA的分离、纯化、克隆到目的基因的鉴定、表达等过程设计了一系列基础实验，形成一个完整的、具较强的连续性和系统性的大实验，融会贯通各有关技术方法以帮助学生巩固有关分子生物学的相关理论知识，并较系统地学习和掌握分子生物学的基本实验方法和技能。

二、 教学要求

熟悉分子生物学实验技术（包括DNA技术、RNA技术、蛋白质技术、杂交技术等）的基本原理方法，掌握DNA提取纯化,定量, DNA克隆, 电泳等基本实验技术，重点掌握质粒DNA纯化技术, 酶切技术, DNA片段回收,重组连接技术, 电泳技术, 转化技术, 基本PCR技术以及蛋白质的诱导表达技术，并要求学生掌握分子生物学实验中的环境安全和污染处理等方法。

三、 课程内容与学时分配（黑体五号）

课程内容与学时分配表

内           容

学 时        

课程简介、实验安排及有关实验材料的准备，仪器设备使用等

3

质粒DNA的提取和纯化

5

质粒DNA的酶切（小量，大量）

2

琼脂糖凝胶电泳检测DNA

4

目的片段回收及定量

6

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化率的检测

6

DNA重组（连接反应）及转化

4

重组克隆的鉴定（酚法提取质粒并酶切，电泳鉴定等）

6

PCR基因扩增

5

外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

4

SDS-PAGE

6

最新分子生物学技术简介

3

Southern blot,Western blot 等（观看录像）

待定

实验一 课程简介及仪器使用，实验材料准备

【目的要求】

1.  通过前言介绍使学生对课程及所有实验内容有整体的了解

2.  分子生物学实验实验室操作安全与污染物处理

3.  学习仪器设备的使用

4.  实验材料的前期准备工作

【实验原理】

1．分子生物学技术相关背景知识及其应用介绍，课程设置要求，实验具体安排，实验室纪律，考核成绩方法等

2．学习离心机的使用

3．微量进样器的使用

4．实验材料的准备

【实验内容】

前言介绍，实验材料准备，离心机的使用，微量进样器使用练习及考核

【实验材料和用品】

离心机，微量进样器（1000，100，10uL），枪头，平皿等

实验二 质粒DNA的提取

【目的要求】

1．学习载体的基本结构

2．了解碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想；

3．掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项基本技术；

4．提取载体和含插入片段的供体质粒。

【实验原理】

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

【实验内容】

质粒载体基础知识、多种质粒提取方法的介绍

碱裂解法提取载体质粒、含目的片段质粒

【实验材料和用品】

恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pUC19、pGEX质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶

实验二  质粒DNA的酶切

【目的要求】

1．了解一般限制性内切酶的各种特性；

2．学习设计酶切方案的一般规律；

3．掌握酶的保存与使用方法；

4．载体与供体进行酶切。

【实验原理】

限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有I型、、II型、III型三类， II型限制性内切酶识别含4－7个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平齐末端和带单链突出端（粘性末端）的DNA片断，常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内切酶都不常用。

影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等，只有正确选用酶反应条件时才能达到最佳酶切效果。此外DNA制品中的污染，如RNA、蛋白质、氯仿、SDS、EDTA,酚、EB、 乙醇、琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等均能抑制酶切活性，影响酶切效果，这种抑制可通过增加酶作用单位数，增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。

酶切计划的实施可按以下次序进行DNA量→酶量（最多占总体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，5’离心后保温酶切。

【实验器材】

台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（20uL, 200 uL 1000uL）,1.5mL  Enpendorf管

 【实验材料】

限制性内切酶及酶切缓冲液、无菌水，

 【实验内容】

1．酶切有关基础知识介绍：

2．小量酶切，电泳鉴定

3．大量酶切

实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

【目的要求】

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

【实验原理】 

DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。

【实验内容】 

1． 电泳基本知识介绍

2． 琼脂糖凝胶的制备

3． 电泳检测质粒DNA及其部分酶切和不完全酶切的产物

4． 质粒及其酶切产物的定量

【实验材料和用品】

 恒温培养箱、台式离心机、高压灭菌锅、水平电泳系统、紫外透射仪、TAE电泳缓冲液、EB、加样缓冲液、琼脂糖等

实验四 目的DNA回收

【目的要求】 

通过本实验学习低熔点琼脂糖法、苯酚法和玻璃粉法等回收和纯化目的DNA片段的方法和技术

【实验原理】

在电泳过程中不同大小的片段分离处于不同的位置，切下并回收含目的片段的琼脂糖凝胶，经抽提、浓缩即可获得目的片段。

【实验内容】   

1. 介绍多种纯化、回收DNA的方法和技术

2. 玻璃纤维柱法或低熔点琼脂糖法回收和纯化目的DNA片段

3．回收目的片段的琼脂糖凝胶法定量

【实验材料和用品】 

台式离心机、-20°C冰箱、低熔点琼脂糖、玻璃纤维柱法回收DNA试剂盒、苯酚，琼脂糖凝胶电泳系统等

实验五 DNA重组（连接反应）

【目的要求】 

通过本实验学习重组DNA连接及鉴定重组子的方法。

【实验原理】 

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做 重组子。重新组合的DNA分子是在连接酶的作用下进行连接的。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

【实验内容】

1.  DNA重组知识介绍

2.  分别回收纯化的外源DNA与酶切的载体分子并定量

3.  按一定比例用T4噬菌体DNA连接酶进行连接反应。

【实验材料和用品】 

  低温水浴锅、冰箱、T4连接酶、外源DNA与酶切的载体等

实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

【目的要求】 

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

【实验原理】

              细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。细菌处于0°C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42°C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Ap+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。

【实验内容】

1． 感受态细胞的制备基础知识及方法简介

2． CaCl2法制备 DH5a或JM109感受态细胞，

3． 标准质粒转化实验，计算转化效率

4． 重组产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞

【实验材料和用品】 

超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等

实验七 重组克隆的鉴定（综合）

【目的要求】 

通过本实验学习重组克隆子的鉴定方法

【实验原理】 

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。如利用a互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。当外源基因插入lacZ基因中的多克隆位点后，将形成白色菌落从而与未插入外源基因的兰色菌落相区别。

【实验内容】  

1.  介绍阳性克隆子的鉴定方法和技术

2.  利用氨苄青霉素抗性

3.  a互补现象

4.  PCR法

5.  酚法提取质粒，酶切法进行阳性重组子的筛选

【实验材料和用品】 

 超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、酶、IPTG、X-gal、LB培养基、氨苄青霉素等

实验八 PCR基因扩增

【目的要求】 

通过本实验学习PCR反应的基本原理和实验技术

【实验原理】 

多聚酶链式反应类似DNA分子的天然复制过程。在待扩增的片段两侧和 与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

【实验内容】  

1.  PCR 原理和多种PCR方法及其应用介绍

2.  学习引物的设计

3.  利用PCR技术扩增已知的基因片段

4.  电泳检测PCR产物

【实验材料和用品】 

 PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳系统、DNA模板、引物1、引物2、dNTP、Taq酶、PCR管等

实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

【目的要求】

通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法

【实验原理】

将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测。

【实验内容】

1．外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

2．多种因素对目的蛋白表达的影响

3．最佳蛋白收获时间的确定等

【实验材料和用品】 

超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、LB培养基、IPTG、表达外源基因的质粒大肠杆菌、对照菌

实验十SDS-PAGE

【目的要求】  通过本实验学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白

【实验原理】  蛋白质与SDS结合后均带有负电荷，在电场作用下按相对分子量大小在板状胶上排列。

【实验内容】  1. SDS-PAGE凝胶的配制

2. 诱导表达的外源基因的检测。

【所需设备】  蛋白质电泳系统、SDS、丙烯酰胺、Bis、TEMED、Aps、低相对分子质量标准蛋白、冰醋酸、甘氨酸、考马斯亮蓝

          实验十一   Southern blot，Western blot等技术

【目的要求】 通过观看录像让学生了解Southern blot，Western blot等技术

【实验内容】

1．Southern blot，

2．Western blot

3．DNA footprint等技术录像

【所需设备】   可进入Internet 的多媒体教学系统及相关录像片，课件等

 实验十二 分子生物学最新技术简介

【目的要求】  通过有关新技术的介绍，让学生了解分子生物学发展的新趋势、新技术。

【实验内容】 

1．通过多媒体教学介绍有关分子生物学最新技术，如酵母双杂交系统、RNA干扰技术，基因敲除技术，Taqman技术、电子克隆、DNA芯片，Genbank和分子生物学相关软件的使用等等。由学生自主选题

2．要求学生针对某一核酸序列寻找同源基因并设计研究该基因的分子克隆方案。

【所需设备】   可进入Internet 的多媒体教学系统、分子生物学相关软件

四、教材与参考书（黑体五号）

教  材：邵雪玲，毛歆，生化及分子生物学实验，（第一版），武汉大学出版社，2004

参考书：【1】 魏群，分子生物学实验指导，（第一版），高等教育出版社，1999

【2】 冷泉港实验室，分子克隆实验指南，（第三版），科学出版社，2002

五、考核方式（黑体五号）

实验操作：20%

实验结果：30%

实验报告：40%

科学素质：10%